Nel 1492, durante l'Inquisizione spagnola, Aguilar De Nerha è introdotto nella Confraternita degli Assassini, un ordine segreto che per secoli si è opposto all'ordine dei Templari. Il suo dito anulare viene amputato per far spazio alla sua Lama Celata, e gli viene affidata la missione di proteggere il Principe di Granada.
Nel 1986, Callum Lynch fa ritorno a casa e trova sua madre morta per mano di suo padre, Joseph Lynch, un membro moderno dell'Ordine degli Assassini. Quando degli uomini armati guidati da Alan Rikkin, CEO della Fondazione Abstergo - la facciata moderna dei Templari - si apprestano a catturare Joseph, ordina a suo figlio di scappare.
Trent'anni dopo, nel 2016, Callum è condannato a morte per l'omicidio di un pappone che ha tentato di derubarlo; viene salvato dalla sua condanna (la sua morte era una messinscena) dalla Fondazione Abstergo e trasportato nella loro struttura a Madrid, in Spagna. Qui apprende che essi stanno cercando la Mela dell'Eden, creata da un'antica civiltà, che contiene il codice genetico del libero arbitrio, per porre fine alla violenza che sta soggiogando la razza umana. La scienziata a capo della compagnia, la Dr.ssa Sophia Rikkin, rivela a Callum che è discendente di Aguilar e lo introduce al progetto Animus. Callum è collegato a una macchina che gli permette di rivivere le memorie genetiche di Aguilar così che l'Abstergo possa apprendere la posizione della Mela dell'Eden.
In Andalusia, Spagna, Aguilar e la sua consorella Maria si appostano per salvare il Principe Ahmed di Granada, che è stato rapito dal leader dei Templari, Tomas de Torquemada. Il ragazzo è stato rapito per costringere il padre del Principe Ahmed, il sultano Muhammad XII, a cedere la Mela dell'Eden. Aguilar e Maria intercettano il carro che trasporta Ahmed, ma vengono sopraffatti e catturati dal rinforzo di Torquemada, Ojeda, mentre Callum viene tirato fuori dall'Animus da Sophia.
Durante la prigionia, Callum fa amicizia con altri discendenti di Assassini, guidati da Moussa, il discendente di un Assassino haitiano del 18° secolo di nome Baptiste, ed inizia ad avere allucinazioni (denominate "effetto osmosi") sia di Aguilar che di suo padre. Callum e Sophia instaurano un rapporto aldilà delle loro sessioni, in cui Sophia si rivela essere la figlia di Alan Rikkin, il CEO dell'Abstergo, e confida a Callum che anche sua madre fu uccisa da un Assassino.
Di ritorno nell'Animus, Aguilar e Maria sono in procinto di essere giustiziati, ma Aguilar prende in mano la situazione liberando sé stesso e Maria, cosa che porta a un inseguimento sui tetti in cui entrambi eseguono il Salto della Fede. La mente di Callum reagisce in modo violento alla sessione, e rimane temporaneamente paralizzato. Più tardi apprende che suo padre, Joseph, è presente nella struttura. Confrontandosi con suo padre riguardo la morte della madre, Callum viene a sapere che come risultato dell'effetto osmosi, le sue memorie genetiche e quelle di Aguilar si stanno fondendo, permettendogli di assorbire le abilità combattive di Aguilar; apprende anche che sua madre era un'Assassina che ha scelto di morire per mano di Joseph, piuttosto che venire sottoposta al progetto Animus dai Templari. Nonostante suo padre lo supplichi di non rientrare nell'Animus, Callum promette di distruggere il Credo dell'Assassino trovando la Mela. Nel frattempo Alan viene spinto dal suo superiore, Ellen Kaye, a chiudere il progetto Animus a causa degli scarsi risultati. Sophia realizza quindi che suo padre Alan è più interessato a sradicare gli Assassini che ad usare la Mela dell'Eden per liberare il mondo dalla violenza.
Callum ritorna di sua volontà nell'Animus, dopo di chè Aguilar e Maria tendono un agguato durante l'incontro tra Muhammad e Ojeda per uno scambio tra Ahmed e la Mela dell'Eden. Riescono ad uccidere le guardie Templari e a riprendere la Mela dell'Eden, tuttavia Ojeda cattura Maria e ordina ad Aguilar di arrendersi. Maria però sceglie di morire, e Ojeda l'accoltella fatalmente prima che Aguilar lo uccida in risposta. Aguilar fugge, eseguendo un altro Salto della Fede, e la forza di Callum causa un malfunzionamento nell'Animus. Aguilar poi consegna la Mela dell'Eden a Cristoforo Colombo, che promette di portare la Mela nella sua tomba. Nel frattempo, Moussa e gli altri prigionieri Assassini danno inizio a una rivolta così da fuggire dalla struttura.
Callum rimane in piedi nella camera dell'Animus e incontra le proiezioni dei suoi antenati Assassini, inclusi Aguilar, suo padre Joseph e sua madre. Callum abbraccia il suo retaggio da Assassino e, avendo assimilato pienamente le memorie genetiche e le abilità del suo antenato, si unisce agli Assassini scappando dalla struttura.
Alan Rikkin e i suoi seguaci, avendo ritrovato la Mela dell'Eden, si riuniscono in un santuario Templare a Londra per celebrare il ritrovamento dell'artefatto. All'interno del santuario, una delusa Sophia incontra Callum, che è venuto per prendere la Mela, ed ella riluttante gli permette di agire. Callum si intrufola dietro Rikkin e lo uccide riprendendosi la Mela dell'Eden, dopo di che gli Assassini partono, promettendo di proteggerla ancora una volta. Terrorizzata dalla morte del padre e del ruolo da lei avuto, Sophia promette vendetta su Callum.
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